嘌呤霉素 (Puromycin Dihydrochloride)是來(lái)源于Streptomyces alboniger的一種氨基核苷類(lèi)抗生素，中文名為嘌呤霉素，常用于篩選通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化、病毒感染等方法能表達(dá)pac基因(puror)的真核或原核多克隆或單克隆細(xì)胞。Puromycin不僅用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，也用于穩(wěn)定細(xì)胞株的維持。本產(chǎn)品的10mg/ml包裝經(jīng)過(guò)濾除菌，可以直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。

Puromycin的特點(diǎn)是快速作用于細(xì)胞，一般2 d內(nèi)可以殺死99%的不表達(dá)pac基因的細(xì)胞。

在革蘭氏陽(yáng)性菌、動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞中，嘌呤霉素通過(guò)抑制蛋白質(zhì)合成而抑制或殺死細(xì)胞。其作用機(jī)制為嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的類(lèi)似物，能夠與核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素與A位點(diǎn)結(jié)合后，不會(huì)參與隨后的任何反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

Pac基因表達(dá)嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，該基因是在Streptomyces alboniger中發(fā)現(xiàn)的。如果表達(dá)基因，就會(huì)對(duì)嘌呤霉素產(chǎn)生抗性，這一特性目前普遍應(yīng)用于篩選表達(dá)pac基因的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定細(xì)胞株等。例如，很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質(zhì)粒圖譜上標(biāo)記為puror)，從而利用嘌呤霉素篩選特定基因的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。嘌呤霉素也可以用來(lái)篩選表達(dá)pac基因的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。

訂購(gòu)信息

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技術(shù)參數(shù)

1.CAS：58-58-2
2.分子式：C22H29N7O5•2HCl

3.分子量：544.43

4.純度：>98%

5.結(jié)構(gòu)式：

使用方法

1.推薦工作濃度：

推薦的作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的嘌呤霉素濃度一般為1-10μg/ml，但最佳工作濃度需要通過(guò)劑量反應(yīng)曲線(xiàn)來(lái)確定。

表1. 部分常見(jiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的推薦工作濃度表

2.嘌呤霉素劑量反應(yīng)曲線(xiàn)的確定(以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒感染為例）
　　嘌呤霉素的有效篩選濃度跟細(xì)胞類(lèi)型、生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝及細(xì)胞所處細(xì)胞周期等因素相關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA或感染病毒的細(xì)胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/感染細(xì)胞的zui低濃度嘌呤霉素非常重要。對(duì)于初次使用的細(xì)胞，一般需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定適合自身實(shí)驗(yàn)體系的劑量反應(yīng)曲線(xiàn)(dose-response curve or kill curve)。
（1）第一天：24孔板中以5~8×104cells/孔的密度接種細(xì)胞，接種夠量的孔以便進(jìn)行后續(xù)的劑量梯度實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。
（2）第二天：在培養(yǎng)過(guò)夜后的細(xì)胞中更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基，該篩選培養(yǎng)基為含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基(如0、1、2.5、5、7.5、10μg/ml等)，更換培養(yǎng)基后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
（3）第三天后：由于嘌呤霉素可以快速作用于細(xì)胞，一般2d內(nèi)可以殺死99%的未表達(dá)pac基因的細(xì)胞，所以在加嘌呤霉素后的1-2 d就可以進(jìn)行觀察細(xì)胞存活率，從而確定有效殺死正常細(xì)胞的藥物zui低濃度。如果細(xì)胞耐藥性比較強(qiáng)，需要每日觀察，一般4-10 d內(nèi)即可確定嘌呤霉素的zui低濃度。
3. 哺乳動(dòng)物穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選
轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)?；蛘吒腥竞性摶虻牟《竞?，即可篩選穩(wěn)定表達(dá)株。
（1）細(xì)胞轉(zhuǎn)染或感染48 h后，將細(xì)胞置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此為處理組。
【注】：當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時(shí)，抗生素作用zui明顯。細(xì)胞過(guò)于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會(huì)明顯下降，所以細(xì)胞的密度最好不超過(guò)25%。建議同時(shí)做一個(gè)正常細(xì)胞的對(duì)照組。轉(zhuǎn)染或感染48 h后，如果細(xì)胞過(guò)密也可以消化后重新接種細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜后即可進(jìn)行嘌呤霉素篩選。
（2）每隔2-3 d，更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。
（3）篩選7 d后，對(duì)照組正常細(xì)胞應(yīng)該100%死亡，處理組中存活的細(xì)胞為表達(dá)pac基因的細(xì)胞。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行多克隆或單克隆細(xì)胞的篩選。
【注】：每日進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要24 h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在2-10 d。
（4）待細(xì)胞可以穩(wěn)定生長(zhǎng)后，嘌呤霉素的濃度可以減半用于后續(xù)的培養(yǎng)。在得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后，一般建議嘌呤霉素也須持續(xù)加入，并2-3 d更換含有嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)液。

注意事項(xiàng)

1.本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，溶解后，須用一次性針頭濾器過(guò)濾除菌。

3.抗生素不穩(wěn)定，請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)盡快使用。

4.以上數(shù)據(jù)均來(lái)自公開(kāi)文獻(xiàn)，和元李記暫未本產(chǎn)品進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證，僅供參考。